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La Stevia rebaudiana B. es la única planta que se conoce que produce edulcorante natural no calórico denominado steviósido, el cual es 300 veces más dulce que el azúcar de caña. Este estudio fue realizado con el propósito de establecer un protocolo de producción in vitro del cultivo a partir de segmentos nodales, así como establecer un costo por planta propagada. En la etapa de establecimiento se evaluó la consistencia del medio (sólido o líquido), la concentración de macroelementos Murashige y Skoog (MS) (50 ó 100%), el tipo de citocinina (kinetina o 6- bencilaminopurina) y la cantidad de cada citocinina (0, 2, 4, ó 6 μM/L) en un medio basal de MS. El mayor tamaño de brotes resultó en el medio líquido MS con 50% de macroelementos y 6 μM de bencilaminopurina (BAP). En la etapa de multiplicación este tratamiento fue sometido a tres cantidades de kinetina (2, 4 ó 6 μM) para inducir más brotes y crecimiento. Para esta etapa, el mejor resultado se obtuvo en el medio con 6 μM de kinetina. Las pruebas para el enraizamiento in vitro de las vitroplantas se realizaron en un medio basal de MS con tres tipos de auxina: ácido indoleacético (AIA), ácido indolebutírico (AIB) o ácido naftaleneacético (ANA) y cinco concentraciones para cada tipo de auxina; la mayor cantidad y la mejor calidad de raíces se obtuvo utilizando 0.5 mg/L de ANA a los 15 días después de su inducción. Las plantas más altas y el mayor número de plantas aclimatadas se obtuvieron usando microtúneles en bolsa plásticas y con un substrato compuesto por Pro-Mix ‘BX’:arena (1:1). Bajo condiciones de laboratorio, a partir de un explante que se establezca en la Etapa I o de establecimiento se obtiene aproximadamente 8,000 vitroplantas listas para aclimatación, empleando una tasa de multiplicación de 6, a un costo promedio de $ 1.69 por vitroplanta aclimatada. Palabras clave: Aclimatación; cultivo de tejidos; edulcorante natural; hierba dulce; micropropagación; microtúneles DOI: http://dx.doi.org/10.5377/ceiba.v47i1-2.442 Ceiba, 2006. Volumen 47(1-2):11-18