Выбор референсных генов для количественной ПЦР в реальном времени на образцах шести видов масличной камелии на основе секвенирования РНК

Количественная ПЦР в реальном времени становится рутинным методом изучения экспрессии генов. Однако экспрессию генов масличной камелии невозможно точно анализировать количественно из-за отсутствия подходящих референсных генов. С целью обнаружения стабильно экспрессирующихся референсных генов нами собраны образцы разных тканей (в том числе корней, стеблей, листьев, цветков и семян) шести видов масличной камелии. Из базы данных секвенированных РНК (RNA-seq) семян Camellia oleifera С.Abel отобрали нуклеотидные последовательности потенциальных референсных генов и сконструировали для каждого из них специфические ПЦР-праймеры. Определили пороговые циклы (Ct) для всех реакций каждого образца. Стабильность экспрессии потенциальных референсных генов рассчитывали на основе данных Ct с применением трех пакетов программ – geNorm, NormFinder и BestKeeper – и получили сходные результаты. Показано, что экспрессия традиционно используемых генов TUB -3 и АСТ7 и нового гена CESA относительно стабильна у всех видов и во всех тканях. Однако ни один из генов не экспрессировался на достаточно стабильном уровне во всех органах всех изученных видов, поэтому оптимальное число референсных генов, необходимых для точного нормирования, варьировало от двух до шести. С использованием как стабильно, так и менее стабильно экспрессирующихся референсных генов сравнили экспрессию генов скваленсинтазы (SQS) и скваленэпоксидазы (SQE), связанных с метаболизмом сквалена и чайного сапонина, важных компонентов семян масличной камелии. Подтвердили правильность выбора референсных генов. Показано, что лучшие результаты получают при использовании оптимального для каждой ткани каждого из шести видов масличной камелии числа референсных генов.