Investigation of the signalling network of the nuclear β-amylases in Arabidopsis thaliana

The ability of plants to adapt to changing conditions has enabled them to colonize and thrive in very diverse and dynamic environments.One of the keys to their success is the capacity to perceive a wealth of internal and external cues and consequently fine-tune their developmental strategy, including the rate at which energy resources built-up through photosynthesis are utilized.Control over the allocation of assimilated carbon is of central importance, hence a number of sensing mechanisms exist that function under abundance or scarcity of carbohydrate and energy resources.Previously, two proteins of the amylase family, BAM7 and BAM8, were proposed as sugars sensors and signal transducers involved in adjusting plant growth.These proteins possess an inactive enzyme-like domain evolved from the starch degrading paralogs and presumed to bind a carbohydrate ligand.They also possess a DNA-binding domain, derived from the BZR1-family of transcription factors (TFs), and consequently are referred to as BZR1-BAMs.The preferred DNA element bound by BZR1-BAMs overlaps with TF-binding motifs including the brassinosteroid (BR) responsive motif and the G-box motif implicated in light and energy regulation.It was suggested that, through the similarity in DNA sequence recognition, the BZR1-BAMs exert an antagonistic effect to BR signalling.More recently, it was proposed that the BAM domain may bind the disaccharide trehalose 6-phosphate (Tre6P), a known sugar-derived signal metabolite, resulting in a change in TF activity.However, it remains unclear under which internal and/or environmental conditions the BZR1-BAMs' function is most crucial.Furthermore, little is known about the network of interactions that enables BAM7 and BAM8 to play their role in the context of plant development.To start to address these unanswered questions, I designed and constructed a luciferase-based reporter line for assessing BZR1-BAM TF activity.This line was used as the basis for a forward genetic screen which led to the identification of several factors potentially involved in the regulation of the transcriptional output through BAM8.The identified proteins are involved in processes such as the control of gene expression and in the removal of post-translational modifications -known mechanisms for the regulation of TFs.Although these findings will need to be validated through further investigation, this proof-of-concept study is of significant interest and will allow BZR1-BAMs function to be explored and contextualised in the future.In a second approach, I used tandem mass spectrometry to show that several residues of the BAM8 transcription factor domain are phosphorylated in vivo.Through different interaction studies, protein sequence analysis, and in vitro phosphorylation assays I provide evidence that Casein Kinase 2 is one of the cellular factors responsible for BAM8 modification.By observing that the development of SOMMARIOLa capacit delle piante di adattarsi a condizioni mutevoli ha permesso loro di colonizzare e prosperare in una variet di ambienti in costante cambiamento.Una delle chiavi del loro successo l'abilit di percepire un gran numero di stimoli interni ed esterni e di modificare di conseguenza la propria strategia di sviluppo, ivi inclusa la velocit di utilizzo delle risorse energetiche acquisite attraverso la fotosintesi.Il controllo dell'assegnazione del carbonio assimilato ad uno o all'altro processo di centrale importanza, dunque esistono un certo numero di meccanismi di percezione attivi in condizioni di abbondanza o scarsit di carboidrati e risorse energetiche.Due proteine della famiglia delle -amilasi, BAM7 e BAM8, sono gi state proposte in precedenza come sensori dei livelli di zuccheri e trasduttori del relativo segnale, con implicazioni nelle regolazione della crescita della pianta.Tali proteine posseggono un dominio di derivazione enzimatica, evolutosi da paraloghi attivi nell'idrolisi dell'amido, che ipoteticamente in grado di riconoscere un ligando di natura glucidica.BAM7 e BAM8 sono dotate anche di un dominio di legame al DNA, derivato da fattori di trascrizione della famiglia BZR1.In funzione di tali caratteristiche strutturali BAM7 e BAM8 sono state denominate BZR1-BAM.La sequenza di DNA preferenzialmente riconosciuta dalle BZR1-BAM sovrapposta ad un motivi di legame di fattori di trascrizione che includono l'elemento di risposta ai brassinosteroidi (BR) e la G-box, implicata nella regolazione di risposte alla luce ed ai livelli energetici. stato proposto che attraverso la similarit nella sequenza di DNA riconosciuta, le BZR1-BAM antagonizzino l'effetto dei brassinosteroidi.Pi di recente, stato proposto che il dominio BAM leghi il disaccaride trealosio 6-fosfato (Tre6P), un noto metabolita di derivazione glucidica con funzione di segnale, cos determinando un cambiamento dell'attivit trascrizionale delle proteine.Tuttavia, non ancora chiaro in quali condizioni interne e/o ambientali la funzione delle BZR1-BAM sia di maggior rilievo.Inoltre si conosce solo in parte il network di interazioni che consente a BAM7 e BAM8 di svolgere il proprio ruolo nel contesto dello sviluppo della pianta.Per cominciare rispondere a questi interrogativi tuttora irrisolti, facendo uso del gene reporter della luciferasi ho progettato e prodotto una linea per valutare l'attivit delle BZR1-BAM.Tale linea stata la base per uno screen fondato sui concetti della forward genetics che ha condotto all'identificazione di diversi fattori potenzialmente coinvolti nella regolazione dell'attivit trascrizionale di BAM8.Le proteine identificate sono implicate in processi quali la regolazione dell'espressione genica e la rimozione di modificazioni post-traduzionali -meccanismi gi noti nel controllo dei fattori di trascrizione.Nonostante questi risultati necessitino di prove aggiuntive per essere validati, il presente studio rappresenta una prova 6 di concetto di significativo interesse che permetter la futura indagine e contestualizzazione dell'attivit delle BZR1-BAM.Con un secondo approccio, utilizzando spettrometria di massa in tandem, ho mostrato che numerosi residui del dominio di attivazione trascrizionale di BAM8 sono fosforilati in vivo.Attraverso diversi studi di interazione proteina-proteina, analisi della sequenza proteica e assay di fosforilazione in vitro ho fornito delle prove che Casein Kinase 2 uno dei fattori cellulari responsabili della modificazione di BAM8.Inoltre, avendo osservato che lo sviluppo di piante di Arabidopsis che over-esprimono versioni fosfo-mutate di BAM8 fortemente alterato rispetto a quello di piante che over-esprimono la forma wildtype della proteina, sono giunta ad ipotizzare che la fosforilazione regoli negativamente la attivit trascrizionale di BAM8.Quest'osservazione supportata dal profilo di espressione genica delle linee succitate, studiato attraverso il sequenziamento dell'RNA: il numero di geni deregolati e la grandezza dei cambiamenti sono maggiori di quelli osservati in una linea che over-esprime la forma wild-type di BAM8.Il confronto tra i profili di espressione genica delle line che esprimono versioni fosfo-mutate di BAM8 e quelli di piante cresciute in assenza di luce o in condizioni che riproducono l'ombreggiamento, o ancora con quello di una linea che possiede elevate concentrazioni di Tre6P mi inducono a proporre che le BZR1-BAM agiscono nel network di trasduzione del segnale che regola l'utilizzo delle risorse in condizioni di scarsa disponibilit di energia e in situazioni di stress. possibile che questo si verifichi attraverso il maggiore legame al DNA quando i livelli del supposto ligando, il Tre6P, sono bassi.I risultati presentati in questo studio costituiscono un'ulteriore linea di supporto all'idea che le BZR1-BAM siano sensori metabolici che agiscono per accoppiare la disponibilit di risorse alla crescita, integrando questo tipo di informazioni nel complesso network utilizzato anche dai sistemi di trasduzione di segnali ormonali. Starch biosynthesis and degradationStarch is made of two types of glucose polymer: branched amylopectin and near-linear amylose.The linear parts of these molecules form helices -double helices in the case of amylopectin and single helices in the case of amylose.The double helices of amylopectin align into layers thereby creating the insoluble starch granule.In leaves, starch is synthetized and degraded in the chloroplast, where all the required biosynthetic enzymes localize.In Arabidopsis, multiple starch synthases (SS) were reported that can initiate amylopectin and participate in the elongation of its constituent chains.In addition, granule bound starch synthase (GBSS) is responsible for the formation of amylose within the developing starch granule.However, these enzymes are not sufficient for the production of the insoluble starch granule which needs in addition branching enzymes (BEs) to create branch points and debranching enzymes (DBE) to tailor its final structure such that it can crystallise efficiently (Streb and Zeeman, 2012).The coordinated action of multiple enzymes is required also for starch degradation at night.Transient starch is broken down at a more-or-less constant rate to produce maltose and glucose that fuel plant metabolism (Zeeman et al., 2010).An important class of enzymes for starch breakdown is -amylase (BAM).BAMs are exo-acting enzymes that release maltose units from the non-reducing ends of glucan in the hydrolysis of transitory starch and the mutant exhibits elevated starch levels and reduced amounts of maltose at night, relative to wild-type plants.However, the double mutant bam1bam3 shows an even more severe starch accumulation and reduced maltose levels than bam3, indicating BAM1 as an active isoform in the leaves, even though starch and maltose levels are unaltered in the bam1 single mutant.Recent studies demonstrated that under normal conditions BAM1 expression is higher in guard cells than in leaves.There, starch degradati