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Introducción Xerospermophilus spilosoma muestra una notable variación geográfica y morfológica que ha generado debate sobre su estatus taxonómico. Actualmente se discute si representa una única especie o un complejo de especies crípticas que incluiría a X. perotensis. Aunque esta última presenta mayor tamaño corporal y un patrón dorsal distintivo, los análisis genéticos actuales no respaldan su reconocimiento como especie válida. El objetivo de este trabajo fue delimitar las posibles unidades evolutivas dentro del complejo X. spilosoma Materiales y métodos Se analizaron 25 secuencias del gen mitocondrial cytb usando fragmentos de 690 pb de X. spilosoma y X. perotensis, de ocho localidades distintas. Se realizaron inferencias filogenéticas mediante Máxima Verosimilitud e Inferencia Bayesiana estimando tiempos de divergencia, así como análisis de distancias genéticas y redes de haplotipos. Se aplicaron tres métodos de delimitación de especies, además de evaluarse el nicho ecológico por especie y sobreposicionamiento entre especies del complejo X. spilosoma. Resultados Se identificaron cuatro linajes con 22 haplotipos únicos con distancias genéticas interpoblacionales entre el 3 y el 6%. Los métodos de delimitación de especies sugieren entre una y cuatro especies potenciales. Mientras que la comparación de los nichos ecológicos mostró solapamientos bajos. Discusión La evidencia genética y aabiental obtenida suguiere que X. spilosoma corresponde a un complejo de al menos tres linajes evolutivamente independientes. El complejo se originó en el Mioceno, hace más de 5 Ma, con eventos de divergencia concentrados entre 3.5 y 1.5 Ma, en concordancia con barreras geográficas como los ríos Grande y Nazas y la Faja Volcánica Transmexicana. Estos resultados, resaltan la necesidad de conservar estas poblaciones como unidades evolutivas independientes, especialmente la de Perote, por su aislamiento y singularidad ecológica y genética. Palabras clave: Cytb; Desierto Chihuahuense; Río Grande; Taxonomía.